細胞培養知識（一）

1 冷凍管應如何解凍？ 
取出冷凍管後， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鍾内全部融化， 並(bìng)注意水面不可超過冷凍(dòng)管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形
。另冷凍(dòng)管由液氮桶中取出解凍(dòng)時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 

2 細胞冷凍(dòng)管解凍(dòng)培養時(shí)， 是否應馬上去除DMSO？ 
除少數特别注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕(jué)大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之後， 應直接放入含有10-15ml新鮮(xiān)培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換(huàn)新鮮(xiān)培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍(dòng)後細胞無法生長(zhǎng)或貼附之問題。 

3 可否使用與原先培養(yǎng)條(tiáo)件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已适應之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條(tiáo)件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即适應， 造成細胞無法存活。 

4 可否使用與原先培養條(tiáo)件不同之血清種類(lèi)？ 
不能。血清是細胞培養上一個(gè)極(jí)爲重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對於(yú)細胞的生長會産(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細胞無法存活。 

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。
 
6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作爲pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量将決(jué)定細胞培養時(shí)應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量爲每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 爲每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基？ 
視細胞生長密度而定
， 或遵照細胞株基本數據上之更換(huàn)時間(jiān)，按時更換(huàn)培養基即可。
 
8 培養(yǎng)基中是否須(xū)添加抗生素？ 
除於(yú)特殊篩(shāi)選系統中外
， 一般正常培養狀态下
， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素
。
 
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度爲0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶後(hòu)應立即少量分裝於(yú)無菌試管中， 保存於-20 °C，避免反複冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 並可減少污染之機會。 

10 懸浮性細胞應如何繼(jì)代處(chù)理？ 
一般僅(jǐn)需持續加入新鮮培養基於(yú)原培養角瓶中， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可将培養(yǎng)角瓶口端稍微擡(tái)高， 直到無法容納(nà)爲止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至适當(dāng)濃(nóng)度， 重複前述步驟即可
。 

11 欲将一般動(dòng)物細胞離心下來(lái)，其離心速率應爲多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般爲300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鍾， 過高之轉速， 将造成細胞死亡。 

12 細胞之接種密度爲何？ 
依照細胞株基本數據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。 

13 細胞冷凍(dòng)培養基之成份爲(wèi)何？ 
動(dòng)物細胞冷凍(dòng)保存時zui常使用的冷凍(dòng)培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長(zhǎng)用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由於(yú)DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可将DMSO 直接加入細胞液中， 必須(xū)使用前先行配制完成。 

14 DMSO 之等級(jí)和無菌過(guò)濾之方式爲何？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級， 必須爲Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即爲無菌狀況， *次開瓶後(hòu)應立即少量分裝於(yú)無菌試管中， 保存於4°C， 避免反複冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 並(bìng)可減少污染之機會。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。 

15 冷凍保存細胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置於4 °C 30~60 分鍾→ （-20 °C30 分鍾*） → -80 °C 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍(dòng)管置於(yú)已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 

16 細胞欲冷凍保存時
， 細胞冷凍(dòng)管内應有多少細胞濃(nóng)度？
 冷凍管内細胞數目一般爲1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 爲宜
。 

17 應如何避免細胞污染？ 
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、黴菌、病毒和黴漿菌。主要的污染原因爲無菌操作技術不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法
。 

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處(chù)理？ 
直接滅菌後丢棄之。 

19 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
不能。除極(jí)有經(jīng)驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。 

20 支原體污染會(huì)對(duì)細胞培養有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長(zhǎng)參(cān)數， 代謝及研究之任一數據(jù)。故進行實驗前，必須確(què)認細胞爲mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數據(jù)方有意義。 

21 偵測(cè)出細胞株有支原體污染時(shí)， 該(gāi)如何處(chù)理？直接滅菌後丢棄，以避免污染其它細胞株。 

22 CO2 培養箱之水盤(pán)如何保持清潔(jié)？ 
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離(lí)子水更換(huàn)之。 

23 爲何培養基保存於4 °C 冰箱中， 顔色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 
培養基保存於4 °C 冰箱中， 培養基内之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(jì)（通常爲phenol red） 的顔色也會(huì)随堿性增加而更偏暗紅(hóng)。培養基偏堿之結果， 将造成細胞生長(zhǎng)停滞或死亡。若培養基偏堿(jiǎn)時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。 

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？ 
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 

25 購買之細胞冷凍(dòng)管經解凍(dòng)後，爲何會發(fā)生細胞數目太少之情形？ 
研究人員在冷凍(dòng)細胞之培養時(shí)出現細胞數目太少， 大都是因爲離(lí)心過(guò)程操作上的失誤， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍(dòng)後(hòu)不要立刻離心， 應待細胞生長(zhǎng)隔夜後(hòu)再更換培養基即可。 

26 購(gòu)買(mǎi)之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細(xì)胞培養時(shí)出現存活率不佳， 常見原因可歸納爲：培養基使用錯(cuò)誤或培養基品質不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質不佳。解凍(dòng)過程錯(cuò)誤。冷凍(dòng)細胞解凍(dòng)後， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認爲死細胞。培養溫度使用錯(cuò)誤。細胞置於(yú)-80 °C 太久。 

27 收到之冷凍(dòng)管瓶身破裂，瓶蓋(gài)有裂紋，或瓶蓋(gài)脫落之原因？ 
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因爲操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管於(yú)放入和取出液氮桶時，均應立刻将冷凍管再一次扭緊。