細胞培養知識（二）

無菌操作基本技術
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作台（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鍾滅菌，以70% ethanol 擦拭無菌操作擡面，並開啓無菌操作台風扇運轉10 分鍾後，才開始實驗操作。每次操作隻處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基
，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢後，将實驗物品帶出工作台，以70% ethanol 擦拭無菌操作擡面。操作間隔應讓無菌操作台運轉10 分鍾以上後，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞
，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利於氣流之流通。實驗用品以70% ethanol 擦拭後才帶入無菌操作台内
。實驗操作應在擡面之中央無菌區域
，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開後
，以手夾住瓶蓋並握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿将瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套後才進行實驗。對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特别小心操作，並選擇适當等級之無菌操作台（至少Class II）。操作過程中，應避免引起aerosol 之産生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，並避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。 5.3. 無菌操作台内之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

實驗用品
1. 種類?
  1.1. 細胞培養實驗用品均爲無菌，除瞭玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均爲塑料無菌制品。
  1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用
。
  1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
  1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2 種不同材質，其中polypropylene （PP） 爲不透明材質，polystyrene （PS） 爲透明材質
，可依實驗需要而選擇适合材質之離心管。
  1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。
  1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗淨後才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗淨後分别用一次與二次去離子水沖洗幹淨，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
  3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鍾，置於oven 中烘幹。
  3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以幹熱滅菌170℃, 4 小時。  
  3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鍾處理。

培養基
1. 液體培養基貯存於4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養基（加血清） 存放期爲六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培養基配制（以1 升爲例）：
  3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清，因此粉末培養基之配制體積爲900ml，pH 爲7.2 - 7.4。NaHCO3 爲另外添加
，若将NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分别溶解後才混合，然後用CO2 氣體調整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因爲氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。   3.2. 材料：
   3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水
，水品質非常重要）
   3.2.2. 粉末培養基
   3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
   3.2.4. 電磁攪拌器
   3.2.5. 無菌血清瓶
   3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
   3.2.7. pH meter
   3.2.8. 真空幫浦
   3.2.9. CO2 氣體
  3.3. 步驟：
   3.3.1. 取粉末培養基溶於700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
   3.3.2. 稱取适量之NaHCO3 粉末（數量依培養基種類而異
，表一）溶於200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然後通入CO2 氣體至飽和
，約3-5 分鍾。
   3.3.3. 将溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混後溶液之pH應爲7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若爲太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
   3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，标示培養基種類、日期、瓶号等，貯存於4℃。（血清亦可加入培養基中一起過濾）
   3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試
。
4. 配制培養基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞於6-well plate （或35mm TC dish） 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天後，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 4.2.3. 去除培養基，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1），室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數，並比較之，若新配制或新批号的培養基對細胞生長不佳，則丢棄之。